【期刊導讀】侯金林/李詠茵/唐利波教授團隊：干擾素α通過B細胞與T細胞的強化連接增強抗HBV特異性免疫應答

編者按：HBV的消除依賴于適應性免疫，慢乙肝（CHB）患者實現(xiàn)臨床治愈的一個可行途徑是通過免疫調(diào)節(jié)恢復乙肝病毒特異性免疫功能。干擾素α（IFN-α）對免疫系統(tǒng)具有廣泛的作用，包括增強樹突狀細胞和單核細胞的功能，促進B細胞活化和抗體類別轉(zhuǎn)換，以及在特定感染中差異塑造細胞免疫。目前IFN-α治療的總體臨床治愈率仍在不斷的優(yōu)化策略中逐步提高，因此誘導最佳的適應性免疫機制在對抗HBV中至關(guān)重要。

IFN-α介導的T細胞重構(gòu)對于實現(xiàn)CHB患者的最佳治療應答是必不可少的（相關(guān)鏈接）。而B細胞除了抗體的產(chǎn)生，還可通過遞呈抗原和提供共刺激信號，促進保護性T細胞應答。來自B細胞的細胞因子，如IL-6、IL-27、IFN-γ和TNF-α，在T細胞分化中也很關(guān)鍵。但是對B細胞在IFN-α介導的HBV特異性免疫中的作用知之甚少。

近期，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院的侯金林教授、李詠茵教授和唐利波教授團隊在Antiviral Research上發(fā)表了一項關(guān)于B細胞在IFN-α治療期間的作用研究，結(jié)果表明：B細胞耗竭會損害功能性T細胞亞群，包括HBV特異性CD8+ T細胞，并導致HBV清除延遲；IFN-α治療增強HBV特異性CD8+ T細胞的應答的潛在機制與PEG IFNα通過B細胞的抗原呈遞和共刺激功能增強B細胞與T細胞的連接有關(guān)。

研究方法

本研究納入南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院6例未經(jīng)治療的HBV感染患者和4例HBeAg陽性、接受聚乙二醇干擾素α（PEG IFNα）治療的患者。

分別利用患者血樣及μMT小鼠模型（B細胞缺陷小鼠）進行實驗分析：將pBlank質(zhì)粒（空白對照）、pAAV/HBV1.2質(zhì)粒（包含1.2倍全長A型HBV基因組）和pIFNα4質(zhì)粒（使肝內(nèi)IFN-α長期表達，并在小鼠模型中被證實具有有效的抗HBV作用）分別水動力注射在μMT小鼠模型中觀察B細胞對IFN-α介導的T細胞應答的影響；利用患者血樣進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），分析B細胞和T細胞亞群之間的串擾，以及IFN-α治療的CHB患者縱向血樣中潛在的分子和通路特征。

研究結(jié)果

01

B細胞缺乏會阻礙HBV特異性細胞免疫應答

與野生型小鼠（WT）相比，缺乏成熟B細胞的μMT小鼠外周總CD4+ T細胞的頻率顯著增加，可能是由于B細胞亞群數(shù)量減少。脾臟中CD4+ T細胞以及外周和脾臟中CD8+ T細胞的頻率有所減少。在功能性T細胞亞群中，發(fā)現(xiàn)B細胞缺乏導致CD4+ T細胞和CD8+ T細胞中效應記憶T細胞（TEM）和中央記憶T細胞（TCM）的頻率減少。此外，與生發(fā)中心反應相關(guān)的濾泡輔助性T細胞（Tfh）和濾泡細胞毒性T細胞（Tfc）在μMT小鼠中的比例也整體下降。

在注射后的第28天和56天，μMT小鼠肝內(nèi)CD8+ T細胞的頻率顯著低于對照組。同時，μMT小鼠肝內(nèi)IFN-γ的產(chǎn)生減少，提示細胞毒性T細胞的功能減弱。因此，μMT小鼠的血清HBsAg、HBeAg、肝內(nèi)HBcAg清除延遲，且不能產(chǎn)生血清抗-HBs。

不同小鼠模型的抗HBV細胞免疫應答

02

IFN-α介導的抗HBV應答具有B細胞依賴性

在體外使用PEG IFNα刺激CHB患者的外周血單核細胞（PBMCs），發(fā)現(xiàn)PEG IFNα的加入明顯誘導了CD19+ B細胞上CD69和CD86的表達。pIFNα4質(zhì)粒已被證實在小鼠模型中具有有效的抗HBV作用，但在μMT小鼠中注射pIFNα4質(zhì)粒后，血清HBsAg和HBeAg水平升高，說明IFN-α發(fā)揮抗HBV作用的B細胞依賴性。

作為一種多效性細胞因子，IL-21在促進B細胞生存、分化和功能方面具有顯著作用，且與CHB患者良好的治療結(jié)果相關(guān)。在質(zhì)粒注射后的第30天，Il21r-/-小鼠（IL-21受體缺失）脾內(nèi)和肝內(nèi)漿母細胞大量減少，盡管IFN-α誘導的B細胞分化在Il21r-/-小鼠中仍存在，但與WT相比明顯減弱。此外，與對照組相比，注射pIFNα4的Il21r-/-小鼠HBV抗原清除能力仍保留，但有所減弱，提示IL-21參與了pIFNα4誘導的抗HBV作用，但并非完全必要。

B細胞和IL-21在IFN-α介導的抗HBV應答中的作用

03

IFN-α增強HBV特異性細胞免疫

在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到IFN-α誘導T細胞亞群的分化和顆粒酶B的產(chǎn)生。與pBlank組相比，注射pIFNα4的WT小鼠脾內(nèi)CD4+ T細胞擴增，其次是CD8+ T細胞。同時，pIFNα4注射后第20天誘導脾內(nèi)HBV包膜特異性產(chǎn)生IFN-γ的CD8+ T細胞頻率顯著增加，注射后第10天和第20天檢測到肝內(nèi)HBV核心特異性產(chǎn)生IFN-γ的CD8+ T細胞的頻率顯著增加，從而促使血清HBV DNA大幅降低。

IFN-α注射小鼠的抗HBV細胞免疫應答 ；C - F：用重疊肽刺激小鼠，檢測脾內(nèi)和肝內(nèi)IFN-γ+CD4+和IFN-γ+ CD8+ T細胞的頻率，這些重疊肽跨越HBV核心蛋白（core）、包膜蛋白（env）或總HBV蛋白（all）。

04

IFN-α增強的HBV特異性細胞免疫具有B細胞依賴性

在B細胞缺乏的情況下，pIFNα4組和pBlank組之間肝內(nèi)HBV核心特異性CD8+ T細胞的頻率沒有差異，且在pIFNα4注射后第20天脾臟和肝臟中HBV特異性產(chǎn)生IFN-γ的T細胞沒有增加。提示B細胞在IFN-α誘導的抗HBV細胞免疫中不可或缺的作用。

B細胞缺失的情況下，IFN-α誘導的細胞免疫應答

05

在PEG IFNα治療過程中，B細胞介導的T細胞抗原呈遞增強

對接受PEG IFNα治療的HBeAg陽性CHB患者在0周、4周和12周收集的PBMCs進行scRNA-seq。擬時分析顯示，IFN-α治療能有效誘導T細胞向效應/記憶亞群的末端分化。

對差異基因（DEGs）進行分析，單核細胞、B細胞和T細胞中部分基因的表達在基線和治療后有明顯的差異，表明IFN-α治療引發(fā)了強烈的免疫調(diào)節(jié)。通過GO功能富集分析將B細胞或T細胞在治療第4周和12周時的表達譜與基線表達譜進行比較。在IFN-α處理后，B細胞中上調(diào)的DEGs富集在抗原處理和呈遞途徑，而T細胞的DEGs顯著富集在與細胞因子應答、免疫效應過程、T細胞激活和IFN-γ產(chǎn)生的相關(guān)通路中。

PEG IFNα治療的CHB患者適應性 免疫系統(tǒng)的單細胞測序擬時分析

B細胞或T細胞在治療第4周和第12周與基線；對比上調(diào)的DEGs GO富集分析

06

IFN-α顯著增強B細胞與T細胞的連接

利用CellPhoneDB和CellChat分析細胞間一般通信的縱向動態(tài)，B細胞亞群和CD8+效應亞群之間的通信明顯上調(diào)。使用ICELLNET分析B細胞向T細胞的通信，B細胞亞群與T細胞，特別是CD8+ T細胞，連接增強。同時，共刺激分子對的相互作用在IFN-α治療期間持續(xù)增強，表明B細胞發(fā)揮了抗原呈遞功能，以幫助T細胞免疫。

通過scRNA-seq分析PEG IFNα 治療過程中細胞間的縱向通信

肝霖君有話說

IFN-α以B細胞依賴的方式協(xié)調(diào)保護性HBV特異性細胞免疫，其潛在機制與由抗原呈遞和共刺激相互作用所介導的B細胞與T細胞的強化連接有關(guān)，表明了IFN-α在先天性免疫和適應性免疫調(diào)節(jié)上的獨有特征。已有數(shù)據(jù)表明PEG IFNα治療慢乙肝有利于重塑B細胞亞群（相關(guān)鏈接），并且可以通過濾泡輔助性T細胞刺激B細胞分化，促進HBsAg血清學轉(zhuǎn)換（相關(guān)鏈接）。也有研究證明了在HBV感染或其他病毒感染模型中B細胞增強CD8+ T細胞殺傷效應的途徑，強調(diào)“B - CD8+ T細胞”增強效應的有益結(jié)果。本研究結(jié)果表明，B細胞在IFN-α治療過程中參與細胞免疫方面具有不可替代的作用。B細胞缺失導致功能性T細胞亞群的應答受損，特別是在HBV感染背景下的CD8+ T細胞亞群。因此，以“IFN-α - B - T細胞”為靶點的潛在聯(lián)合療法可能有利于慢乙肝患者的治療療效。

參考文獻：

Zhong S, Li Q, Wen C, et al. Interferon alpha facilitates anti-HBV cellular immune response in a B cell-dependent manner[J]. Antiviral Res, 2022, 207: 105420.