AASLD2020：新型CRISPR/CAS9靶向HBx代表了一種有效的控制乙肝病毒誘導的腫瘤進展的非病毒治療方法

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在維持乙型肝炎病毒(HBV)的持續存在和促進乙肝病毒誘導的肝細胞肝癌維持干細胞特性（stemness）、侵襲和轉移的分子機制中扮演著重要角色。

GautamBuddha大學等研究機構的研究人員在2020美國肝病學會年會（AASLD2020）上發表了一項利用CRISPR/Cas9系統設計并合成了一種HBx基因特異性的小引導RNA(SgRNA)，并在體外研究該小引導RNA(SgRNA)對HBV基因組整合肝癌細胞的HBx表達、HBsAg水平以及干細胞和上皮間質細胞轉化(EMT)特性的影響的研究。

研究人員首先在基于硅的工具上使用CRISPORweb設計出具有最小脫靶錯配的針對HBx的sgRNA，然后通過克隆到非病毒eSpCas9-2A-Puro（PX459）V20載體（HBx-CRISPR）中進行開發。

在體外，通過基于脂質的轉染方法，用HBx-CRISPR或對照載體（PX459）轉染HepG2-215（表達HBV的穩定肝癌細胞）。通過免疫熒光，集落形成，HBsAgELISA和實時PCR評估了新設計的HBx-CRISPR的效率和效果。

研究人員使用設計的HBx-CRISPR切除了全長465bp的HBx基因，導致96小時后HepG2-2.15細胞中HBx基因表達的顯著敲低（降低18倍，p<0.01圖1A）。ELISA分析表明，經過96小時后，HBx-CRISPR處理使細胞上清液中的HBsAg水平降低了50％。

與用對照載體（p<0.05，圖1B-C）和pGFP-HBx（p<0.01，圖B-C）轉染的細胞相比，用HBx-CRISPR處理的細胞還表現出形成的細胞集落數量顯著減少。免疫熒光研究表明，與對照轉染的細胞相比，在HBx-CRISPR處理的細胞中上皮蛋白CDH1（E-鈣粘蛋白）的表達增強，而間充質蛋白VIM（波形蛋白）的表達降低（圖D）。

在基因表達研究中，與對照組和pGFP-HBx轉染細胞相比，經HBx-CRISPR處理的細胞VIM基因顯著降低(p<0.05，圖E)，而CDH1基因顯著上調(p<0.01，圖F)。

綜上研究表明，研究認為新型CRISPR/CAS9系統靶向HBx能有效降低HBV-HCC細胞的HBx基因表達、HBsAg水平以及細胞的干性和間質特性。這項研究代表了一種有效的控制乙肝病毒誘導的腫瘤進展的非病毒治療方法。（更多肝病新藥研究信息敬請關注“肝臟時間”微信公眾號）！

信息源：

TARGETINGHBxBYCRISPR/Cas9SYSTEMEFFECTIVELYREDUCESTHEEMTANDSTEMNESSCHARACTERISTICSOFHCCCELLSINVITRO.